伊人影视,亚洲爆乳无码一区二区三区,久久av,欲妇荡岳丰满交换

　　【中國儀器網 行業應用】PCR 技術，即聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是由美國 PE Cetus 公司的 Kary Mullis 在 1983 年(1993 年獲諾貝爾化學獎)建立的。其原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。即通過模擬體內DNA復制條件，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術。
 

　　熒光定量PCR(qPCR)是PCR較為傳統的PCR技術，經過多年的發展，已是很成熟的實驗方案了。其中，常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在這二種方法當中，Taqman法又以其特異性高、定量，得到廣大用戶的認可。
 

　　但事實上Taqman法熒光PCR還是一個相對定量的辦法。它測的是一個Ct值，也就是PCR到第幾個循環，熒光強度達到了一個設定值。要想用Taqman方法得到：樣本中到底有幾個目標基因的拷貝，那么還是要再做一個標準品的(qPCR)曲線。才能知道樣本的Ct值落在標準曲線的哪個位置上。再進一步推算出樣本中的拷貝數量。
 

　　這樣做，它首先要做一個標準曲線，這樣的話，一來增加了工作量，另一方面，因為引入了標準品，也會產生相應的誤差，導致實驗中又多引入了一個實驗的誤差變量。
 

　　科學家為了克服傳統定量PCR的上述兩個弱點，那么又新發明了微滴數字PCR。  數字PCR(Digital PCR-dPCR)技術是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統定量PCR(qPCR)技術不同，數字PCR采用定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數。  由于這種檢測方式具有比傳統qPCR更加出色的靈敏度和特異性、性，dPCR迅速得到廣泛的應用，這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現出的優勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景，已經受到越來越多的關注。  數字PCR在醫學領域哪些研究方向發揮重要作用呢？小編盤點了以下11個研究方向。
 

　　1. 基因表達差異研究
 

　　檢測時*不依賴傳統的Ct值即可實現真正意義上的定量，從而提供了比實時熒光定量PCR更的基因差異表達研究，尤其對于那些靶基因表達差異微小的情況：microRNA、lncRNAs等的表達分析、等位基因的不平衡表達、單細胞基因表達分析、Exosome內核酸分子定量分析等。
 

　　2. 拷貝數變異(CNV)研究
 

　　微滴化的樣品處理及檢測，這種擺脫Ct值的計算方法而直接獲取目標基因的拷貝數，為拷貝數變異的研究提供了的檢測精度。是其他諸如二代測序、芯片雜交等平臺無法達到的，因此采用數字PCR能夠有效對NGS、aCGH的實驗結果進行驗證，并具有成本低、通量高的特點。
 

　　3. 低豐度及稀有序列的定量
 

　　目前對于低豐度目標序列的檢測，定量PCR、雜交、毛細管測序及NGS等方法都因受到背景DNA的干擾，使得檢測靈敏度及性都達不到精細定量的要求(如定量PCR檢測中Ct值大于33的情況下，其重復性就不是很高)， 而微滴式數字PCR系統通過核心的微滴化處理，使得稀有的核酸序列從大量的背景DNA中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及重復性。
 

　　此外，由于樣品微滴化處理的同時，也將樣品中可能存在的抑制劑進行了分裝，提高了數字PCR擴增對于抑制劑的耐受程度，因此可具體應用于很多臨床樣品(血液、尿液、糞便、痰液、腦脊液等)中對腫瘤核酸標記物的檢測。一般而言，毛細管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約在10%;NGS的靈敏度可達到1%;而ddPCR的檢測下限為0.001%。
 

　　4. 甲基化含量鑒定
 

　　作為表觀遺傳學研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現階段有不同的方法或技術來進行研究：如傳統的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序統計法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等。這些方法皆因方法學的問題而不能獲得的定量，而微滴式數字PCR系統通過對樣品的微滴化處理及目標因子的拷貝數定量，為甲基化程度的定量檢測提供了一種全新的技術。
 

　　5. *的伴隨診斷
 

　　常用體液來源(如血液，胸腹水，唾液及尿液等)的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源，前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾，實現腫瘤標記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴增檢測等，應用于腫瘤醫學的伴隨診斷。
 

　　6. 無創*
 

　　無創傷的產前診斷, 如21號染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地貧檢測或已知父母基因型的其它核酸病檢測(孟德爾相關遺傳疾病)。目前標本來源主要為血液，而待檢測的胎兒DNA受到母體DNA的干擾，影響了檢測的準確性。而QX200檢測系統*的微滴化技術*可以作為二代測序法的補充來進行的無創傷產前診斷，從而提高工作效率及節約成本。
 

　　7. 病原微生物的檢測(病毒、細菌等)
 

　　疾病預防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統的實驗室目前主要采用基于TaqMan探針法的定量PCR體系對病原微生物進行核酸水平的檢測，而這些目前正在使用著的檢測體系可以無縫地轉移到QX200上，從而滿足該類實驗室對于檢測結果的要求：靈敏度更高、重復性更好、無需依賴標準曲線的定量結果，同時操作簡便。
 

　　對于其他類型的研究實驗室，也可以利用ddPCR靈敏度高的特點，對各種樣品中的病原微生物展開廣泛的研究。如HIV抗逆轉錄病毒治療過程中病毒殘留量的監控;HBV耐藥突變的檢測;HCV的分子分型;抗**的院內感染監控;環境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。
 

　　8. 轉基因食品或成分的檢測
 

　　目前在確定轉基因作物或成分的含量時采取定量PCR的標準曲線法，這種方法需要依賴于已知濃度的標準品(Certified Reference Materials Calibrants, CRMCs)。ddPCR定量的方式可以*解決這些標準物質的定標工作。
 

　　9. 二代測序輔助建庫
 

　　目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當擴增引物增加時，由于擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率;如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現對于少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數據。
 

　　10. CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證
 

　　CRISPR-Cas9技術的發明，是基因編輯技術的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數字PCR技術可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發明了以CRISPR為基礎的SHERLOCK技術可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但定量評估時仍采取了數字PCR進行確認。
 

　　11. *的實時監控
 

　　已有數篇文章報道了使用數字PCR技術對患者治療過程中的循環腫瘤DNA(ctDNA)進行檢測，實時監控疾病進展。在非小細胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結果。與影像學及其他常規指標相比，ctDNA突變及豐度改變通常會提前數月出現，這樣就可以提醒醫生及時調整治療方案，使患者得到更有效的治療。
 

　　隨著數字PCR熒光通道的增加和多指標檢測的成熟，數字PCR將會進入更多應用領域，有力推動生命科學、醫學診斷、檢驗檢疫、農業等領域的快速發展。