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應用FRR葉綠素熒光誘導技術估算有效光反應中心含量
PSII可與PSI協同從水中獲取電子生成還原體、驅動光化學反應和植物營養循環。因此有效PSII光反應中心([PSII]active)的含量可作為植物生產力評估的基礎因子，同時也是評估植物光合速率、研究植物脅迫響應的關鍵。而對于液體樣品，[PSII]active含量同樣是評估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物對脅迫的響應的關鍵參數。但傳統上缺少穩定、可靠、快速的 [PSII]active含量的測量方法。
本文將介紹加拿大蒙特愛立森大學的Campbell教授的研究------應用FRR葉綠素熒光誘導技術進行[PSII]active含量估算的方法。該方法有效解決了傳統測量方法存在的問題。其原理是：在一定體積下：
a)F’o強度與[PSII]active色素含量相關；
b)σ’PSII與PSII色素總含量相關。
因此，F’o/σ’PSII可以代表單位體積的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而這兩個參數都可以利用快速飽和及弛豫熒光誘導程序(fast repletion and relaxation (FRR) ?uorescence induction)獲得。(注：σ’PSII: 光適應狀態下PSII的有效吸收截面；F’o：光適應下的基礎熒光。)
為了證明該方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化熒光淬滅影響很小、測量快速并且穩定、具有時間分辨性、可應用于對湖泊和海洋水體的初級生產力的快速評估，該研究進行了209次成對測定，對不同培養和處理條件下的海洋藍藻、分別在高光和低光處理下的原生態型球藻、北極和溫帶的綠藻、兩種中心硅藻進行測試。
由于藻類的生理狀態對培養密度、光照條件、氣體狀態、溫度、pH值等都很敏感，進而直接影響所得參數和公式的科學性，所以需要精確控制培養條件并實時監測培養狀態。因此本研究使用FMT150光養生物反應器對中心硅藻兩個藻株分別在2種不同狀態下進行培養和監測，精確控制營養濃度、溫度、光照，并自動進行恒化培養。在培養過程中儀器自動使用水蒸氣飽和的空氣氣泡混勻，避免沉降。(FMT150光養生物反應器介紹見后附)
之后使用FL3500(當前升級為FL6000)測量每個樣品的F’o和σ’PSII，用以計算[PSII]active。FL3500可自動控制和測量樣品溫度、預施光照、光化光、單周轉飽和光閃、QA再氧化等8種默認測量程序、精確自定義程序等。
同時使用熒光光纖氧氣傳感器測量密閉比色皿里樣品的溶氧濃度。氧氣的測量可由儀器自帶軟件程序自動控制。
放氧測量過程如下圖所示：在FRR測量過程中，氧氣濃度隨激發光變化并與時間(橫軸)相對應。將氧探頭固定在FL3500自動控溫探頭上，一同插入FL3500測量單元內的待測樣品中。FL3500具有磁力攪拌功能，該功能可由觸控面板控制，也可由FL3500自帶軟件FluorWin程序精確定義。
在初始300s的暗適應過程中記錄氧氣濃度作為暗呼吸值；之后用低光(20 µmol.m-2.s-1)進行預光照激活光系統并測量氧氣；在一個FRR程序結束后立刻測量氧氣濃度作為在FRR過程中的呼吸。二者差值用于估算樣品中[PSII]active含量。
之后將樣品置于光下300 s；再次進行FRR誘導(見下圖)并測量氧濃度。再次估算樣品中[PSII]active含量。公式為：
μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×(25.025×10-3s Flash-1)×(4 Flash 1×1 PSII/O2)
FRR測量過程如下圖所示：*行300 μs的暗適應。預光照之后使用40個(間隔2 μs)單周轉光閃(1.2 μs， µmol.m-2.s-1)的激發序列進行FRR誘導，以逐漸關閉全部PSII；在這個過程中得到Fo、FM、σPSII、ρ(表示PSII 光反應中心的連通性)。之后降低光閃重復速率，PSII逐漸打開，此過程持續0.25 s。黑暗2 s，PSII打開。再施加第二次FRR誘導，得到F’o2、F’M2s、σ’PSII2s……
使用放氧法得到的[PSII]active對FRR得到的 [PSII]active=F’o/σ’PSII 公式進行校正，得到校正參數。
本研究驗證了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假設，應用FRR測量得到的[PSII]active矯正公式適用于本文所述所有藻類樣品，包括：呈指數增長的樣品、短期生理波動的非穩態樣品、光抑制樣品、低濃度樣品、光適應下的樣品，并且受非光化熒光淬滅影響很小。
因此可以用FRR測量程序來估算湖泊和海洋不斷變化的環境中的初級生產力。
本案例文獻： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.
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